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丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測(cè)試劑盒

注意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。

貨號(hào): BC0380

規(guī)格: 50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體1mL×1 支，-20℃避光保存；

試劑三：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×1 支，4℃保存；

試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1 支，4℃保存；

試劑七：粉劑×1 支，4℃保存；

工作液的配制：臨用前把試劑四、五、六、七轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解待用；用不完的試劑 4℃保存一周。

產(chǎn)品說(shuō)明：

     PDH（EC 4.1.1.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成羥乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來(lái)。PDH催化丙酮酸脫氫，同時(shí)還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導(dǎo)致605nm光吸收的減少。

需自備的儀器和用品：

     可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本的處理

    稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL 試劑一和 10μL試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨，4 ℃ 11000 g離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

     1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng) 605nm，蒸餾水調(diào)零。

     2、每個(gè)樣本需要900μL工作液，按樣本數(shù)加一取出一定量的工作液于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）中孵育5min。

     3、空白管：在1mL比色皿中加入900 µL工作液和50µL水，混勻，立即記錄605nm處初始吸光值A(chǔ)1和1min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算 ΔA空白=A1-A2。

     4、測(cè)定管：在1mL 比色皿中加入900 µL工作液和50µL樣本，混勻，立即記錄 605nm 處初始吸光值A(chǔ)3和1min后的吸光值A(chǔ)4，計(jì)算ΔA測(cè)定=A3-A4。

三、PDH 活性計(jì)算

    （1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

     單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

PDH活性（U /mg prot）=[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V樣×Cpr)÷T

=904.762×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷Cpr

    （2） 按樣本鮮重計(jì)算

     單位的定義：每g組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

PDH活性(U/g鮮重)=[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=913.81×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

     單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

     PDH 活性(U/10⁴ cell)=[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=1.828×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)

     V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

注意事項(xiàng)：

1、測(cè)定過(guò)程中所有樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2、測(cè)定管的ΔA值在0.01-0.25之間，若測(cè)定管的ΔA值大于0.25，需將樣本進(jìn)行稀釋。 

 相關(guān)文獻(xiàn)：

《Engineering Corynebacterium glutamicum for high-titer biosynthesis of hyaluronic acid.》 作者:Fangyu Cheng,Huimin Yu,Gregory Stephanopoulos 期刊:Metab. Eng. 影響因子:7.808 PMID:31301358
 

丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測(cè)試劑盒